イネのファミリー9糖質加水分解酵素の単離

吉田 光毅*1・小前 幸三*2・西谷 和彦*3

合成オーキシン,2,4‐Dはイネ幼根切片で内鞘細胞からの側根の原基形成を促進する。私達はこの初期段階にエンド‐1,4‐β‐グルカナーゼの活性が上昇する事を見い出した(Plant Cell Physiol.34:507-514)。このオーキシンで活性上昇する酵素活性を等電点の異なる3画分に精製し,それぞれSDS‐PAGEと等電点電気泳動によりクマシーブルー染色で単一のバンドである事を確認した。最も活性の高い画分(精密質量分析による分子量:51216Da,等電点:5.5)を用いて基質特異性を調査した。本画分はCM‐セルロース,リン酸膨潤セルロース,(1→3,1→4)‐β‐グルカン,セロオリゴ糖(DP4以上)だけでなく,アラビノキシランやキシランのようなタイプII細胞壁の主要マトリクス多糖や,グルコマンナン,1,4‐β‐キシロヘキサオースも分解した。つぎに精製タンパクのN末端・内部アミノ酸配列をcDNAやゲノム配列と対応させて,全アミノ酸配列を決定した。本遺伝子の翻訳産物は糖加水分解酵素ファミリー9に属し,全長が約68kDaの長さで,精製タンパクよりもC末端が約130残基ほど長い事が示された。

キーワード: イネ,セルラーゼ,細胞壁,バイオマス,酵素,遺伝子

*1 技術センター土木技術研究所水域・生物環境研究室
*2 (独)作物研究所
*3 東北大学生命科学研究科

Isolation and Characterization of a Rice Glycoside Hydrolase Family 9 Enzyme

Kouki YOSHIDA *1, Kozo KOMAE *2 and Kazuhiko NISHITANI *3

A synthetic auxin, 2,4-D, stimulates the activity of endo-1,4-β-glucanase at the early stage of lateral root formation in rice (Oryza sativa L.)(Yoshida & Komae (1993) Plant Cell Physiol. 34: 507-514). We purified this auxin-stimulated activity into three protein fractions to homogeneity (based on SDS-PAGE and IEF with Comassie blue-staining) from primary root tissues and investigated the substrate specificity of the major fraction (MW based on MALDI-TOF-MS: 51216 Da, pI:5.5). This fraction specifically hydrolyzed 1,4-β-glycosyl linkages of CM-cellulose, phospho-swollen cellulose, (1-3,1-4)-β-glucan, arabinoxylan, xylan, glucomannan, cellooligosaccharides (DP>3) and xylohexaose. The complete amino acid sequence of this endo-1,4-β-glucanase was determined by protein sequencing combined with the deduced sequence of the corresponding (auxin up-regulated) cDNA and genomic clones. The protein encoded by the cDNA clone (OsCel9A) has a greater deduced molecular weight (ca. 68 kDa) due to the presence of an extra peptide of about 130 amino acids at the C-terminus.

Keywords: rice, cellulase, cell wall, biomass, enzyme, gene

*1 Hydraulic and Bio Engineering Section, Civil engineering Research Institute, Technology Center
*2 National Institute of Crop Science
*3 Tohoku University